Készülékünk:

A szekvenálás ABI PRISM® 3100-Avant Genetic Analyzer készülékkel történik, a futtatásokhoz a gyártótól (ABI) rendelt reagenseket használjuk, a mintafelvitelt az általuk megadott paraméterek szerint végezzük. A szekvenáló futás kapilláris elfo alapján történik. A szekvenálandó mintát egy PCR reakcióban fluoreszcensen jelölt dideoxi-NTP-kel kell jelölni, a reakcióban, a láncterminálás következtében különböző méretű jelölt fragmentek keletkeznek, amelyek a kapilláris elfo során elválnak. Az érzékelő ablakhoz érkező jelölt fragmentet lézer gerjeszti, a fluoreszcens jelet egy CCD kamera fogadja.

A szekvenálás:

PCR termék, plazmid, és gDNS minták szekvenálását vállaljuk. 600-700 bázis hosszúságig tudunk szekvenálni, a szekvenciák a hatszázadik bázisig megbízhatóak. A szekvenciákra garanciát vállalunk abban az esetben, ha a mintákról mellékelve megkapjuk a minőségi ellenőrzés adatait (agaróz gél fotó, OD ratio >1.7, koncentráció).

Minden polimer feltöltés után ellenőrizzük a készülékünk működését egy gyári kontroll minta futtatásával (310/377/3100/3100-Avant™/3130/3130xl Genetic Analyzer Sequencing Standards, BigDye® Terminator v3.1). Ezért ha a kontroll minta futása sikeres, de a megrendelőé hibás, nem vállalunk felelősséget a hibáért. A sikertelen illetve a megismételt szekvenálás költségeit a megrendelőnek kell vállalnia. Természetesen megpróbálunk tanácsot adni a hibás mintákkal kapcsolatban.

Általunk preferált, fogadott minták:

1. Szekvenálási reakció után tisztított, beszárított termék.

2. Kis mintaszám esetében a szekvenálási reakciót is vállaljuk, ebben az estben a DNS templátot és a primert kérjük.

Fragment analízis (mikroszatellita elemzés, genotipizálás):

Készülékünkön a D filterre van kalibrációval a következő festékeket tudjuk detektálni: 6FAM, HEX, NED, ROX. A futtatáshoz szükségünk van 5ul PCR termékre, amely tartalmazza a jelölt fragmenteket, illetve a Size Standard-ra 1ul/minta.

A fragment analízissel kapcsolatban felmerülő további kérdésekkel (kitek, reakció optimalizálás) kérjük forduljon az Applied Biosystems/LifeTechologies képviselőihez.

Minta előkészítés szekvenálásra:

PCR termék esetében fontos, hogy egy konkrét terméket használjunk templátként. Ha gélen futtatva több termék is látszik, akkor a megfelelő méretű terméket a gélből ki kell tisztítani.

Plazmidok esetében ügyeljünk arra, hogy a kultúránkat 1 klónból indítsuk.

Minden esetben ügyeljünk arra, hogy alkohol ne maradjon a mintában.

A szekvenáló PCR reakció során a mintákat jelölni kell ddNTP-kel, a reakcióban a primer párnak csak az egyik tagját kell használni. A jelölt terméket meg kell tisztítani a be nem épült ddNTP-től, majd be kell szárítani.

I. Szekvenálás:

A futtatások eredményét mintánként két fájl tartalmazza. A ’seq’ kiterjesztésű a szekvenciát tartalmazza, ’txt’ fájlként megnyitható. Az ‘ab1’ kiterjesztésű fájl tartalmazza az elektroferogrammot, a következő ingyenes programokkal megnyitható.

• EditView software, Applied Biosystems (Macintosh OS 9.x, 1.5 Mbytes).

• FinchTV software (Macintosh OS X, Windows, Linux).

• 4Peaks (Macintosh OS X).

• Chromas software (Windows/DOS).

II. Fragment analízis:

Egy ’fsa’ kiterjesztésű fájl mintánként, amely az Applied Biosystems által forgalmazott programmal megnyitható Genotyping Software.

/Vissza a Funkcionális analízisekhez/